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稳定转染    

 

相关知识：

 

稳定转染或持久的转染是用于建立克隆的细胞系，这种细胞系中转染的目的基因整合到染色体DNA中并指导适量目的蛋白的合成。一般来说（由细胞类型决定），形成稳定转染细胞的效率比瞬时转染的效率低1到2个数量级。利用可选择的遗传标记物有利于从非转染细胞的毕竟中分离出稀少的稳定转染物。

 

实验流程：

 

1）常规细胞：

 

a. 杀伤曲线绘制；

 

b. 转染质粒，铺板，用不同的抗生素浓度筛选细胞单克隆；

 

c. qPCR或Western Blot检测稳定克隆的外源基因表达水平。

 

2）特殊细胞：

 

a. 根据细胞特点、实验特点或实验需求，设计实验方案并与客户探讨确定实验方案；

 

b. 预实验，通过转染含有GFP报告基因的质粒确定最佳转染试剂，并优化转染条件；

 

c. 杀伤曲线绘制；

 

d. 转染质粒，铺板，用不同的抗生素浓度筛选细胞单克隆；

 

e. qPCR或Western Blot检测稳定克隆的外源基因表达水平。

 

瞬时转染   

 

相关知识：

 

采用瞬时转染的方法能够方便快捷地对基因功能进行研究与分析，且基因表达水平高，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。

实验流程：

 

1）质粒：

 

a. 进行预实验，通过转染含有报告基因的质粒优化转染条件；

 

b. 转染条件确定后，按照客户方案进行转染；

 

c. qPCR或Western Blot检测转染效率。

 

2）siRNA:

 

a. 根据基因序列，设计并合成siRNA；

 

b. 进行预实验，通过转染带有荧光标记的阴性对照siRNA优化转染条件；

 

c. 通过qPCR和Western Blot验证siRNA的沉默效率，筛选siRNA最佳使用浓度。

 

 

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慢病毒包装

 

相关知识：

 

在有关转染的研究中，为了感染原代细胞和难感染的细胞系，研究者借助于病毒载体实现。由于慢病毒可以同时感染分裂和非分裂细胞、整合性以及免疫原性低等优点，目前在RNAi的研究中，基于慢病毒构建的shRNA被最广泛的使用。而在RNAi研究需要长期观察或者需要进行动物实验时，基于慢病毒构建的shRNA的优势更为明显。

实验流程：

 

1）根据目的基因相关信息（序列，序列号等），对每条目的设计3条siRNA序列，其中一条序列为阴性对照组；

 

2）根据设计好的siRNA序列，设计，合成两条互补的短片段的DNA；

 

3）对合成好的DNA片段进行稀释，退火，连接到线形化处理过的载体，转化，涂平板，过夜培养；

 

4）通过 PCR的方法筛选阳性菌落，进行测序，分析测序结果；

 

5）对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的 siRNA病毒穿梭质粒；

 

6）利用构建好的质粒做转染实验，48小时后通过实时荧光定量和Western的方法分析目的基因，筛选出一条最有效的siRNA序列；

 

7）筛选出的高效重组载体和病毒包装质粒共转染 293T细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液；

 

8）浓缩、纯化病毒液，测定滴度。

 

您只需提供：

 

靶基因信息。

 

我们提供：

 

慢病毒包装实验报告单，提供1*108TU/ml病毒（1 ml），对照病毒（200 μl）等。

 

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