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甲基化实验

背景知识：

DNA甲基化是最早发现的DNA修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。结构基因含有很多CpG结构，2CpG和2GpC中两个胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化，且两个甲基集团在DNA双链大沟中呈特定三维结构。基因组中60%～ 90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。DNA的甲基化修饰是基因表达调控的一种重要手段。

主要检测方法及原理:

亚硫酸氢钠测序法

亚硫酸氢钠测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法。重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增（引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响）所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。

BSP检测流程图

亚硫酸氢钠测序法：此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的优点。限制性：每次至多能够检测450 bp内的基因甲基化状态。

甲基化特异性的PCR

甲基化特异性是一种特异位点甲基化检测技术。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。因此从理论上讲，用不同的引物做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。

甲基化特异性的PCR ：这是检测基因甲基化的经典方法，是一种简便的、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方法。可以用于高通量样品基因特异位点甲基化的检测。

样品准备条件：

细胞样品：收集细胞后放入液氮中速冻保存或速冻24 h后转入-80 °C冰箱保存。

组织样品：动物组织一般取材后立即放入液氮中速冻保存，液氮冻存24 h后可转入-80 °C冰箱保存。特殊组织（植物等）建议直接进行甲基化检测实验。

所有样品的处理和保存过程中，切忌反复冻融。

样品运输条件：样品运输条件根据实验样品的处理条件，可以选择液氮或者干冰运输。

您只需提供：

新鲜且足量的样品（组织不少于50 mg，细胞不少于107，全血不少于500 μl），或纯化好的符合实验要求的DNA（≥ 5 μg/样），检测的基因信息，相关文献等。

我们提供：

实验报告单，MSP电泳图/BSP测序图等。

甲基化芯片