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案例分析

 

案例1：拟南芥花叶根组织m6A RNA甲基化谱

 

原文：Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6 A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana

 

期刊：Genome Biology 影响因子：13.21

 

西北农林科技大学联合中科院和普渡大学，借助m6A RNA甲基化测序技术，对比拟南芥花，叶，根组织中（每种组织有两个生物学重复）m6A RNA甲基化情况。结果发现检测组织中m6A RNA甲基化修饰程度比人类高10%左右，占转录组的83%。

 

案例2：不同品系拟南芥m6A RNA甲基化谱 

 

原文：Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana

 

期刊：Nature communications 影响因子：12.12

 

芝加哥大学联合北大，利用m6A RNA甲基化测序对比和品系拟南芥根组织中m6A RNA甲基化谱，发现的分布在两个品种间高度保守。与人类m6A RNA甲基化位点分布情况相比，拟南芥甲基化位点在起始翻译区特异性高表达。

 

案例3：m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通过结合lncRNA促进胶质瘤细胞

 

原文：m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program 

 

期刊：Cancer Cell 影响因子：27.43

 

世界卫生组织将胶质瘤分为四级，其中恶性胶质瘤(GBM)属于极危险的第四级，手术治疗和化疗都难以避免其高复发率。近年来，m6A RNA修饰的研究已成为当今生命科学领域前沿研究之一，不断有高分文章问世。m6A RNA修饰的催化、去除以及识别的分子机理研究越来越清晰，此时人们更关心m6A RNA修饰与重大疾病之间的相关性。近期Cancer Cell报道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神经胶质瘤中具有生理作用。在本研究中，去甲基化酶ALKBH5在恶性胶质瘤干性样细胞表达上调，而ALKBH5高表达的胶质细胞瘤患者预后生存率更差。通过敲低ALKBH5，meRIP鉴定m6A RNA甲基化修饰模式，基因芯片检测差异表达>2倍的基因，筛选到与细胞周期调控相关的FOXM1基因，其在GSCs的自我修复和肿瘤形成中起到关键作用。ALKBH5促使癌基因FOXM1转录本去甲基化，增加FOXM1表达。随后作者发现FOXM1反义长链非编码RNA——FOXM1-AS(LOC100507424)，与FOXM1 mRNA外显子有457个核苷酸互补。结果证实ALKBH5和FOXM1-AS可与FOXM1协同作用，发挥促进恶性胶质瘤肿瘤形成作用。 

 

m6A pri-miRNA测序

 

 

产品详情

 

技术简介

 

近年来，科学家们发现了一种可逆的RNA甲基化—m6A，即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰（N6-methyladenosine，m6A）。研究发现，m6A是真核生物mRNA上常见的一种转录后修饰， m6A在细胞加速mRNA代谢和翻译，在细胞分化、胚胎发育和压力应答等过程中起重要作用。m6A除了分布在 mRNA 中，也出现在很多非编码 RNA中 ，如：pri-miRNA、tRNA、环状RNA和LncRNA等。Nature发表文章，证实在pri-miRNA存在着m6A RNA甲基化修饰。

 

目前对m6A RNA流行检测手段为MeRIP-Seq技术，文奇生物提供成熟m6A RNA甲基化MeRIP-seq服务，技术原理如下： 将甲基化RNA特异性抗体与被随机打断的RNA片段进行共孵育，抓取有甲基化修饰的片段进行测序；同时需要平行测序一个对照（Input）样本，对照样本只含有打断的RNA片段，并不添加RNA甲基化特异性抗体与其共孵育。对照样本用于消除非特异性抓取甲基化片段的背景。对比免疫共沉淀(IP)样本和对照样本（Input）中的序列片段，将RNA甲基化修饰位点定位到转录组上，并根据RNA-seq数据，计算样本中RNA甲基化程度。

 

(m6A)RNA甲基化测序流程（同上图）

 

RNA甲基化测序产品（同上）

 

服务优势

 

一站式服务

 

客户只需提供组织、细胞、体液样品或RNA，文奇生物为您完成从m6A RNA-seq富集，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。

 

优化的实验流程

 

m6A RNA-seq的富集效率是决定数据质量的关键，文奇生物m6A RNA-seq实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程，具有极高的效率和特异性。

 

严格的质控

 

文奇生物对m6A RNA-seq实验每一步骤均设有关键质控，全程监控实验质量，保证客户得到优质数据。

 

专业的生物信息学分析

 

文奇生物拥有专业的生物信息分析团队，帮助客户进行实验数据的全面挖掘。

 

RNA甲基化测序与转录组联合应用

 

可整合RNA甲基化数据和转录组数据进行生物信息学关联分析，揭示RNA甲基化对基因表达调控的影响，深入挖掘RNA甲基化的功能。

 

样品要求

 

样品类型

 

细胞、组织或RNA，其他样本类型请电询。

 

样品量

 

a）细胞：1×108  

b）组织：5 g

c）RNA：300 μg（OD260/280：1.6-2.3；RNA无明显降解28S:18S>1.5或RIN>7）

 

样品运输与保存

 

样品运输：样品置于1.5mL离心管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。

 

数据分析

 

1、识别甲基化富集峰

 

通过高通量测序和生物信息分析，识别（p <10-5）甲基化富集的基因组区域。

 

注：每个样品组做一个Input，以去除基因组背景，降低假阳性率

 

2、RNA甲基富集峰注释※

 

通过生物信息分析利用邻近基因对富集峰进行注释，并根据峰中点相对于已知基因的位置，将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰。

    

3、RNA甲基化富集峰区域的在基因组中的分布※

 

根据注释信息，绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。   

 

4、RNA甲基化位点Motif分析※

 

RNA上甲基化的位点，可能包含某种序列motif。RNA 甲基化酶可能正是通过识别这些motif特异性进行甲基化修饰，从而完成转录后调控功能。我们成功识别了全基因组的RNA上的甲基化位点后，获取序列就能使用生物信息学的手段来搜索这些motif，从而揭示RNA甲基化修饰的机制。

 

5、差异RNA甲基化区域的识别与聚类※

 

文奇生物使用 diffReps 软件进行差异甲基化位点的识别。默认筛选标准为 FDR<=0.05，具体以报告为准。识别样本间的差异甲基化区，发现与特定表型或疾病相关的甲基化区域。

 

6、差异甲基化区的GO与信号通路分析

 

对差异甲基化基因进行功能分类，并发现明显富集的功能条目。

 

7、Reads 的分布※

 

使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS， genebody， TES 等位点的分布情况，可以用来观察 RNA 甲基化对 TSS 等位点是否有偏好。

 

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