广州RIP_文奇生物——医学实验室全流程信息化高手

案例解析

 

案例1：m6A RNA去甲基化酶ALKBH5通过结合LncRNA促进胶质瘤细胞增殖

 

原文：The m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-Like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program

 

期刊：Cancer Cell 影响因子：27.43

 

世界卫生组织将胶质瘤分为四级，其中恶性胶质瘤(GBM)属于极危险的第四级，手术治疗和化疗都难以避免其高复发率。近年来，m6A RNA修饰的研究已成为当今生命科学领域前沿研究之一，不断有高分文章问世。m6A RNA修饰的催化、去除以及识别的分子机理研究越来越清晰，此时人们更关心m6A RNA修饰与重大疾病之间的相关性。近期Cancer Cell报道了m6A RNA去甲基化酶ALKBH5在神经胶质瘤中具有生理作用。在本研究中，去甲基化酶ALKBH5在恶性胶质瘤干性样细胞表达上调，而ALKBH5高表达的胶质细胞瘤患者预后生存率更差。通过敲低ALKBH5，meRIP鉴定m6A RNA甲基化修饰模式，基因芯片检测差异表达>2倍的基因，筛选到与细胞周期调控相关的FOXM1基因，其在GSCs的自我修复和肿瘤形成中起到关键作用。ALKBH5促使癌基因FOXM1转录本去甲基化，增加FOXM1表达。随后作者发现FOXM1反义长链非编码RNA——FOXM1-AS(LOC100507424)，与FOXM1 mRNA外显子有457个核苷酸互补。结果证实ALKBH5和FOXM1-AS可与FOXM1协同作用，发挥促进恶性胶质瘤肿瘤形成作用。

 

案例2. lincRNA 1281上的m6A 甲基化影响细胞分化

 

原文：N6-Methyladenosine modification of lincRNA 1281 is critically required for mESC differentiation potential

 

期刊：Nucleic Acids Research 影响因子：11.56

 

同济大学康九红团队研究发现在mESC细胞中，甲基化转移酶Mettl3能够调控lincRNA 1281发生甲基化，并且与干细胞分化能力直接相关。揭示此过程主要发生在胞浆，且由let-7能够竞争性结合linc1281，从而降低其表达量，从机制上解释了m6A在不影响到表达水平的情况下如何影响生物学功能的问题。

 

m6A mRNA测序

 

产品详情

 

技术简介

 

近年来，科学家们发现了一种可逆的RNA甲基化—m6A，即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上发生甲基化修饰(N6-methyladenosine，m6A)。研究发现，m6A是真核生物mRNA上常见的一种转录后修饰，m6A在细胞加速mRNA代谢和翻译，以及在细胞分化、胚胎发育和压力应答等过程中起重要作用。种种研究迹象表明m6A 存在于很多物种中，占到了 RNA甲基化修饰的80%。m6A除了分布在 mRNA 中，也出现在很多非编码 RNA中 ，如：环状RNA 、LncRNA等。Nature正刊发表文章，证实发生m6A RNA甲基化修饰可以调控mRNA稳定性。而随后Cell Research也发表文章，证实环状RNA也会被m6A甲基化修饰，并会促进环状RNA编码蛋白这一有趣的结论。

 

(m6A)RNA甲基化测序流程（同上图）

 

RNA甲基化测序产品（同上）

 

服务优势

 

一站式服务：

 

客户只需提供细胞、组织或RNA，文奇生物为您完成从MeRIP富集，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。

 

优化的实验流程

 

MeRIP的富集效率是决定数据质量的关键，文奇生物MeRIP实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程，具有极高的效率和特异性。

 

严格的质控

 

文奇生物对MeRIP实验的各个关键步骤进行严格的质控，全程监控实验质量，确保客户得到优质的数据。

 

专业的生物信息学分析

 

文奇生物具有强大的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析需求。

 

特异性高

 

通过抗体特异性富集发生甲基化修饰的RNA片段，以较低的成本实现转录组范围的RNA甲基化研究。

 

样本要求：

 

样品类型：

 

细胞、组织或RNA，其他样本类型请电询。

 

样品量：

 

a) 细胞：1×108

b) 组织：5 g

c) RNA：300 μg (OD260/280：1.6-2.3; RNA无明显降解; 28S:18S>1.5或RIN>7)

 

样品运输及保存：

 

样品运输：样品置于1.5mL离心f管中，封口膜封好，干冰运输。

 

样品保存：细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存; RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。

 

数据分析

 

1. 识别甲基化富集峰

 

通过高通量测序和生物信息分析，识别(p <10-5)甲基化富集的基因组区域。

               

注：每个样品组做一个Input，以去除基因组背景，降低假阳性率

 

2. RNA甲基富集峰注释※

 

通过生物信息分析利用邻近基因对富集峰进行注释，并根据峰中点相对于已知基因的位置，将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰。

 

 

3. RNA甲基化富集峰区域的在基因组中的分布※

 

根据注释信息，绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。           

         

4. RNA甲基化位点Motif分析※

 

RNA上甲基化的位点，可能包含某种序列motif。RNA甲基化酶可能正是通过识别这些motif特异性进行甲基化修饰，从而完成转录后调控功能。我们成功识别了全基因组的RNA上的甲基化位点后，获取序列就能使用生物信息学的手段来搜索这些motif，从而揭示RNA甲基化修饰的机制。

 

5. 差异RNA甲基化区域的识别与聚类※

 

文奇生物使用 diffReps 软件进行差异甲基化位点的识别。默认筛选标准为 FDR<=0.05，具体以报告为准。 识别样本间的差异甲基化区，发现与特定表型或疾病相关的甲基化区域。

 

6. 差异甲基化区的GO与信号通路分析

 

对差异甲基化基因进行功能分类，并发现明显富集的功能条目。

 

7. Reads 的分布※

 

使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS， genebody， TES 等位点的分布情况，可以用来观察 RNA 甲基化对TSS 等位点是否有偏好。

 

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